menghitung kadar parasetamol dalam obat dg HPLC

A. Tanggal praktikum : 23 Oktober 2009
B. Judul Praktikum : TEKNIK HPLC
C. Tujuan Praktikum :
- Memahami cara kerja instrument HPLC untuk analisis kuantitatif
- Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat serta dapat mengikuti manual pengoprasian HPLC
- Dapat menentukan dan menghitung kadar parasetamol dalam sampel obat

D. Tinjauan Pustaka
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Kegunaan umum HPLC adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hamper sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry, HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya mnyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik. Parasetamol :

Skema dan fungsi setiap komponen instrument HPLC :

Keterangan skema :
1. Solvent reservoirs
2. Solvent degasser
3. Gradient valve
4. Mixing vessel
5. Pompa bertekanan tinggi
6. Switching valve dalam"inject position" dan 6’. Switching valve dalam "load position"
7. Sample injection loop
8. Pre-column
9. Analytical column
10. Detektor
11. Data acquisition
12. Waste or fraction collector
Keterangan :
a. Solvent ( unit penghantar/ eluen bertekanan tinggi) :
Pada bagian ini prinsipnya meliputi peralatan reservoir sampel beserta sistem penghilangan gas (degassing), alat pengatur gradien, dan system pompa bertekanan tinggi . Pada peralatan- peralatan HPLC modern umumnya disertai dengan satu atau lebih bejana sebagai tempat eluen yang terbuat dari gelas atau “stainless stell” yang masing- masing berkapasitas 1-2 liter. Biasanya pada reservoir tersebut dilengkapi dengan sistem penghilangan gas terlarut, seperti gas oksigen atau nitrogen. Adanya gas terlarut ini dapat menyebabkan gangguan pada sistem pengatur gradien dari eluen.

b. Unit sistem penyuntikan :
Sampel /cuplikan harus dimasukkan kedalam kolom sebagai lapisan setipis mungkin. Ada dua cara untuk memasukkan cuplikan yaitu dengan cara injeksi dan dengan katup pemasukkan cuplikan makro.
c. Unit kolom:
Ada dua tipe kolom kromatografi cairan yaitu kolom analitik dengan performa tinggi dengan diameter dalam 1-6 mm dan kolom preparatif dengan diameter lebih besar. Tabung kolom dibuat dari kaca dan baja tahan karat. Kolom yang lebih panjang akan menghasilkan resolusi bertambah baik tetapi perlu tekanan yang lebih tinggi .

d. Unit detector:
Fungsinya adalah mendeteksi adanya komponen cuplikan dan mengukur banyaknya komponen. Syarat- syarat detector yang baik adalah mempunyai kepekaan tinggi, gangguan sedikit, daerah respon linear cukup luas, memberikan respon terhadap semua tipe senyawa, dan tidak peka terhadap perubahan kecepatan aliran dan perubahan suhu. Detektor yang paling banyak digunakan adalah detektor fotometer sinar tampak/ UV dan detektor indeks bias.

E. Alat dan Bahan

Alat Jumlah
Perangkat HPLC 1 set
Lumpang dan alu 1 set
Spatula 1 buah
Labu ukur 25 mL 6 buah
Labu ukur 10 mL 6 buah
Neraca analitik terkalibrasi 1 set
Corong pendek 1 buah
Pipet tetes 5 buah
Gelas kimia 100 mL 1 buah
Gelas ukur 500 mL 1 buah
Ultrasonic vibrator 1 set
Statif 1 buah
Kertas saring 1 buah


Bahan Jumlah
Parasetamol p.a 20 mg
Methanol 375 mL
Air 125 mL
Sampel obat 5 tablet
Membran PTFE/ selulosa nitrat 1 buah

F. Bagan Alir Prosedur Kerja
a. Pembuatan fasa gerak :

b. Pembuatan larutan induk parasetamol :
 

c. Pembuatan deret larutan standar parasetamol :

i. Konsentrasi 25 ppm :

ii. Konsentrasi 50 ppm :
 
iii. Konsentrasi 75 ppm :



iv. Konsentrasi 100 ppm :

 

v. Konsentrasi 125 ppm :


d. Pembuatan sampel parasetamol :

 
e. Persiapan instrument HPLC :


G. Cara pembuatan larutan
H. Data Pengamatan
Data Pengamatan
sampel no ppm Area
blanko 0 0
1 25 3750993
2 50 7625221
3 75 10957355
4 100 14450728
5 125 17996025
sampel x 6257688




















I. Perhitungan
1. Konsentrasi parasetamol (larutan standar):
Massa parasetamol yang ditimbang: 6.25 mg

2. Konsentrasi deret larutan standar
Konsentrasi larutan parasetamol (labu 1):


Konsentrasi larutan parasetamol (labu 2):

Konsentrasi larutan parasetamol (labu 3):

Konsentrasi larutan parasetamol (labu 4):

Konsentrasi larutan parasetamol (labu 1):

Analisis dan data pengamatan
Data Pengamatan
sampel no ppm Area
blanko 0 0
1 25 3750993
2 50 7625221
3 75 10957355
4 100 14450728
5 125 17996025
sampel x 6257688


Luas area sampel = 6257688
Konsentrasi parasetamol dalam sampel :


Konsentrasi dalam 25 mL larutan sampel:


Massa parasetamol dalam 25mL sampel


Massa tablet obat yang ditimbang =12,5 mg
%parasetamol=
Massa rata-rata tablet =738,2 mg
Massa paracetamol dalam tablet:
massa rata-rata tablet


J. Pembahasan
Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji yaitu larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE kedalam kolom HPLC dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan bantuan pompa bertekanan tinggi. Didalam kolom, komponen- komponen pada sampel dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena parasetamol merupakan senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV. Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm.
Teknik yang dilakukan kali ini merupakan “reverse phase” atau fasa terbalik karena teknik ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa diamnya menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati kolom ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi yang terukur adalah antara 2,19 hingga 2,2 . Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu citra berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi . Seharusnya tampilan kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang terjadi adalah difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu sendiri disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak merata.
Terdapat beberapa parameter pemisahan dalam HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameter- parameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan secara efisien.
Dari grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel obat. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2 mg diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat disimpulkan bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg per tabletnya .

K. Daftar pustaka

Gholib, Ibnu. (2009). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Hendayana, Sumar. (1994). Kimia Analitik Instrumen. Semarang: IKIP Semarang Press.
Hendayana, Sumar. Kimia Pemisahan.
Khopk, SM. (2007). Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.
Wiji, dkk. (2009). Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen. Bandung: LKI FPMIPA UPI.